代謝研究NMT標(biāo)準(zhǔn)化方案
代謝研究NMT標(biāo)準(zhǔn)化方案
一、視頻資源
二、參考文獻(xiàn)
Leaf Extract from Lithocarpus polystachyus Rehd. Promote Glycogen Synthesis in T2DM Mice
Abnormal mitochondrial function impairs calcium influx in diabetic mouse pancreatic beta cells
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Oscillatory glucose flux in INS 1 pancreatic β cells: A selfreferencing microbiosensor study
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Oxygen consumption oscillates in single clonal pancreatic beta -cells (HIT)
三、常測哪些指標(biāo)
Ca2+、H+、O2、葡萄糖
四、檢測這些離子流、分子流，有什么生物學(xué)意義
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2）科研案例
使用患有糖尿病的KK-Ay小鼠和正常的C57BL/6J小鼠的胰腺β細(xì)胞研究了線粒體的功能和形態(tài)，Ca2+通道，并且使用非損傷微測技術(shù)（NMT）測定了葡萄糖誘導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流。實驗發(fā)現(xiàn)，葡萄糖誘導(dǎo)正常胰腺β細(xì)胞的Ca2+內(nèi)流增加，但是KK-Ay的Ca2+并沒有發(fā)生明顯變化，當(dāng)加入genipin后，能夠恢復(fù)KK-Ay小鼠胰腺β細(xì)胞的Ca2+內(nèi)流。因此，在患有糖尿病小鼠的胰島β細(xì)胞中，缺失線粒體功能是改變Ca2+內(nèi)流導(dǎo)致的胰島素分泌異常的重要因素。胰島組織（Islet）是非常適合用于非損傷微測技術(shù)測定的材料，具有穩(wěn)定而明顯的Ca2+、H+和K+的流速，這為研究糖尿病的機理提供了重要的活體手段。
Li F, Porterfield DM, Zheng XY, Wang WJ, Xu Y, Zhang ZM. Abnormal mitochondrial function impairs calcium influx in diabetic mouse pancreatic beta cells. Chin Med J (Engl). 2012;125(3):502-510.
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1）O2生理功能概述
2）科研案例
通過測定L6肌肉細(xì)胞生理狀態(tài)的UCP3超表達(dá)對葡萄糖和脂肪酸氧化，對線粒體解偶聯(lián)和ROS產(chǎn)生的影響，以及用非損傷微測技術(shù)測定了細(xì)胞的耗氧。實驗發(fā)現(xiàn)肌肉細(xì)胞溫育在血糖正?；蛘哐沁^高的環(huán)境中導(dǎo)致棕櫚酸氧化增加，但是，腺病毒綠色熒光蛋白感染或者慢性低劑量的解偶聯(lián)劑二硝基苯酚對棕櫚酸氧化沒有影響。增加UCP3不影響葡萄糖的氧化，但是二硝基苯酚和胰島素處理引起了葡萄糖氧化的增加。二硝基苯酚引起耗氧的增加和線粒體膜電勢的下降，但是增強UCP3表達(dá)沒有引起線粒體膜電勢改變。最后，線粒體ROS隨著UCP3表達(dá)的增加顯著下降。通過非損傷微測技術(shù)研究UCP3引起的耗氧變化，為糖尿病藥物開發(fā)和篩選提供了活體檢測的手段。
MacLellan JD, Gerrits MF, Gowing A, Smith PJ, Wheeler MB, Harper ME. Physiological increases in uncoupling protein 3 augment fatty acid oxidation and decrease reactive oxygen species production without uncoupling respiration in muscle cells. Diabetes. 2005;54(8):2343-2350.
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2）科研案例
取活體小鼠肝臟組織，添加外源葡萄糖后，利用NMT可以觀測到肝臟組織對葡萄糖的吸收逐漸增加，在加入外源巴馬甜茶提取物后，肝臟組織吸收葡萄糖的速率瞬間上升2-3倍，且在較高的吸收速率水平上維持一段時間。首次通過在體實驗展示了巴馬甜茶提取物急性降血糖的潛力。
Wang J, Huang Y, Li K, et al. Leaf Extract from Lithocarpus polystachyus Rehd. Promote Glycogen Synthesis in T2DM Mice. PLoS One. 2016;11(11):e0166557.
五、如何應(yīng)用NMT開展糖尿病活體組織水平研究
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近年來，世界各國糖尿病的患病率均有極具增加的趨勢，據(jù)WHO統(tǒng)計，1994年糖尿病患者人數(shù)為1.20億，1997年為1.35億，2000年為1.75億，2010年為2.39億，2017年為4.25億。目前，世界糖尿病患者人數(shù)最多的前3位國家為印度、中國、美國，據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟最新數(shù)據(jù)，2017年全球的4.25億糖尿病患者中，中國是患病人數(shù)達(dá)到1.14億，并呈現(xiàn)發(fā)病率升高、患者年輕化的趨勢。糖尿病給患者帶來的并發(fā)癥有160余種，其中80%的糖尿病患者死于心腦血管疾病，而治療糖尿病及其并發(fā)癥的費用占據(jù)國家整個醫(yī)療支出的7%-13%。
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- 指標(biāo)的契合度：葡萄糖指標(biāo)，提供了研究中最直接的指標(biāo)測量。
- 檢測材料廣：在細(xì)胞水平，組織水平都能進(jìn)行檢測，給與研究者不同材料水平的檢測方式，達(dá)到同一研究方向、不同材料水平都能進(jìn)行測量。
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1）ZHANG Zong-ming,et al. Abnormal mitochondrial function impairs calcium influx in diabetic mouse pancreatic beta cells. Chinese Medical Journal. 2012,125(3):502-510.點擊查看全文
2）J. Darcy MacLellan, et al. Physiological Increases in Uncoupling Protein 3 Augment Fatty Acid Oxidation and Decrease Reactive Oxygen Species Production Without Uncoupling Respiration in Muscle Cells. Diabetes. 2005,54:2343-2350.點擊查看全文
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3）D. Marshall Porterfield , et al.Oxygen consumption oscillates in single clonal pancreatic beta -cells (HIT). Diabetes.2000,49:1511-1516.點擊查看全文
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4）D. Marshall Porterfield, et al. Oscillatory glucose flux in INS 1 pancreatic β cells: A selfreferencing microbiosensor study. Analytical Biochemistry. 2011,411(2): 185–193.點擊查看全文
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5）Yingbai Shen, et al. Leaf Extract from Lithocarpus polystachyus Rehd. Promote Glycogen Synthesis in T2DM Mice. PLoS One. DOI:10.1371/journal.pone.0166557 2016.點擊查看全文
六、如何應(yīng)用NMT開展活體組織代謝研究
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- 組織器官水平研究
隨著研究的深入，單細(xì)胞的生理狀態(tài)，以及對不同環(huán)境的生理反應(yīng)，與處于機體組織器官中的細(xì)胞的差異，已逐漸成為研究中的瓶頸。NMT不僅可以檢測單細(xì)胞，還可以實現(xiàn)對細(xì)胞的原位檢測，以及對活體組織器官的在體檢測，很好地彌補了這一研究手段的空白。
- 活體研究
可在離體或在體的情況下，對活體組織，開展代謝研究，無需提取、無需染色。
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1）Wang J, et al. Leaf Extract from Lithocarpus polystachyus Rehd. Promote Glycogen Synthesis in T2DM Mice. Plos One. 2016, 11(11):e0166557.點擊查看全文
2）D. Marshall Porterfield , et al. Oxygen consumption oscillates in single clonal pancreatic beta -cells (HIT). Diabetes.2000,49:1511-1516.點擊查看全文
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3）Land SC, et al. O2 availability modulates transmembrane?Ca2+ flux via second-messenger pathways in anoxia-tolerant hepatocytes. Journal of Applied Physiology.2009, 82:776-783, 1997.點擊查看全文
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4）D. Marshall Porterfield, et al. Oscillatory glucose flux in INS 1 pancreatic β cells: A selfreferencing microbiosensor study. Analytical Biochemistry. 2011,411(2): 185–193.點擊查看全文
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5）J. Darcy MacLellan, et al. Physiological Increases in Uncoupling Protein 3 Augment Fatty Acid Oxidation and Decrease Reactive Oxygen Species Production Without Uncoupling Respiration in Muscle Cells. Diabetes. 2005,54:2343-2350.點擊查看全文
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6）ZHANG Zong-ming,et al. Abnormal mitochondrial function impairs calcium influx in diabetic mouse pancreatic beta cells. Chinese Medical Journal. 2012,125(3):502-510.點擊查看全文
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七、可以檢測哪些樣品
1、動物樣品
1）細(xì)胞
神經(jīng)細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等
2）組織器官
腫瘤、皮膚、胃粘膜、胰島、腦（海馬體等）、胚胎（大鼠、魚）、斑馬魚皮膚/鰓、耳蝸、心臟（香螺）、卵（魚、雞蛋、爪蟾）、骨骼、角膜、脊椎（豚鼠）、肌肉組織（肌纖維、心?。?/p>
3）其它動物樣品
珊瑚、螨蟲、昆蟲（果蠅幼蟲的腸、蟑螂血腦屏障、按蚊、長紅錐蝽）、蝌蚪、水蛭、藍(lán)蟹（微感毛）、變形蟲、水絲蚓
2、植物樣品
1）營養(yǎng)器官
莖：邊材、心材、微管形成層、木質(zhì)部
葉：表皮細(xì)胞、葉肉細(xì)胞、鹽腺細(xì)胞、保衛(wèi)細(xì)胞
2）生殖器官
花：花瓣、花瓣表皮細(xì)胞、花粉
種子：整體、胚
果實：果殼、果皮、果肉（蘋果、柑橘）、籽粒、棉花纖維、棉桃
3）細(xì)胞：植物懸浮細(xì)胞、液泡
4）愈傷組織
3、微生物樣品
酵母細(xì)胞、菌絲、菌落、微藻、細(xì)菌（大腸桿菌）
4、其它生物樣品
周叢生物
5、非生物樣品
金屬、混凝土、泥沙、納米材料、生物醫(yī)藥材料
八、樣品需要做哪些前處理
國際領(lǐng)先的非損傷微測技術(shù)最大的特點就是活體、無損檢測，因此動植物材料在檢測前，不需要任何的液氮速凍、染色、研磨處理等。
1、動物單細(xì)胞
因NMT是活體檢測，故從培養(yǎng)箱中拿出來后，置于培養(yǎng)皿中，直接檢測即可。
2、動物組織
因NMT是活體檢測，無需提前處理。如檢測部位天然暴露在外，如斑馬魚皮膚離子細(xì)胞、側(cè)線毛細(xì)胞，直接檢測即可。如檢測部位位于體內(nèi)，需在檢測時暴露出檢測部位（可采用麻醉的方式），后檢測即可。
3、植物根莖葉等組織器官
天然暴露在外的組織器官，例如根、莖、葉的表面，無需任何處理，直接檢測即可。水培、土培、砂培、平板培養(yǎng)均可。
4、植物原生質(zhì)體/液泡
因NMT是基于微傳感器/探針的非損傷檢測，檢測時不接觸樣品，故原生質(zhì)體、液泡需要從組織或者細(xì)胞中，提取出來后檢測。
5、植物葉片的表皮細(xì)胞、葉肉細(xì)胞、鹽腺細(xì)胞、保衛(wèi)細(xì)胞
無需提前處理。因這些細(xì)胞處于組織內(nèi)部，故檢測時采用撕取等方式，暴露出相應(yīng)細(xì)胞即可。
6、植物花粉管
離體萌發(fā)：在培養(yǎng)皿中萌發(fā)一段時間后即可直接檢測；在體萌發(fā)：將柱頭置于培養(yǎng)皿中，待萌發(fā)一段時間后即可直接檢測。
7、植物果實
無需提前處理。如待測部位位于果實內(nèi)部，需在檢測前暴露出相應(yīng)部位即可。
8、植物懸浮細(xì)胞
無需提前處理。檢測時，置于培養(yǎng)皿中檢測即可。
九、有哪些檢測方式？
即瞬時處理，是指在檢測過程中，在正常測試液中瞬間加入所需的干旱脅迫溶液（PEG或甘露醇等溶液）的處理方法，目的是為了觀察瞬間干旱脅迫下，樣品短時間內(nèi)的離子/分子的變化趨勢，即短時效應(yīng)。
2、預(yù)處理/提前處理好后檢測
是指在干旱脅迫一段較長的時間后（數(shù)十分鐘/數(shù)小時/數(shù)天），觀察植物離子/分子進(jìn)出的情況，即長時效應(yīng)。
十、檢測環(huán)境是空氣還是溶液
檢測時，只要求待測部位浸于溶液中（無需整體都浸在溶液里）。
十一、樣品是如何檢測的
十二、可以送樣檢測嗎
可以送樣檢測。目前非損傷微測技術(shù)測試服務(wù)由中關(guān)村NMT產(chǎn)業(yè)聯(lián)盟統(tǒng)籌管理，由遍布全國的25家NMT創(chuàng)新平臺服務(wù)中心，提供檢測服務(wù)。點擊獲取測試服務(wù)
